BashGU
Electronic Library

     
?

Details
Card Table RUSMARC

Лабораторный практикум с элементами теории по дисциплине «Основы биохимии»: лабораторный практикум / Уфимский университет науки и технологий; автор- составитель П.А. Куксо. — Уфа: Уфимский университет, 2025. — Электрон. версия печ. публикации. — Доступ возможен через Электронную библиотеку УУНИТ. — <URL:https://elib.bashedu.ru/dl/local/KuksoPA_avt.-sost._Laborat.prakt.s element.teorii po discipl.Osn.biohomii_2025.pdf>. — Текст: электронный

Record create date: 2/2/2026

Subject: биохимия; белки; аминокислоты; углеводы; липиды; лабораторные работы

Collections: Учебные и учебно-методические издания; Общая коллекция

Allowed Actions: –

*^% Action 'Read' will be available if you login and work on the computer in the reading rooms of the Library *^% Action 'Download' will be available if you login and work on the computer in the reading rooms of the Library

Group: Anonymous

Network: Internet

Document access rights

Network User group Action
Library BashGU Local Network Authenticated users Read Download
Library BashGU Local Network All Read Download
Internet Authenticated users Read Download
-> Internet All

Table of Contents

  • ЛП
    • ТЕМА 1. БИОХИМИЯ ПРОСТЫХ И СЛОЖНЫХ БЕЛКОВ
    • ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1.1.
    • КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ
    • 1.1.1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)
    • Реакция основана на способности пептидных связей (–CO–NH–) в щелочной среде образовывать комплексные соединения с ионами меди (Cu²⁺) с характерным фиолетовым окрашиванием. Интенсивность цвета прямо пропорциональна количеству пептидных связей в молекул...
    • Рис. 1. Окрашенный биуретовый комплекс с ионами в присутствии щелочи
    • 1.1.2. Нингидриновая реакция
    • Принцип метода: Высокочувствительная реакция на свободные α-аминогруппы. При нагревании с нингидрином аминокислоты, пептиды и белки образуют продукты сине-фиолетового цвета (пурпур Руэмана). Пролин и гидроксипролин дают желтое окрашивание.
    • Механизм реакции состоит из каскада реакций, таких как окисление, деградация углеродного скелета аминокислоты, формирование окрашенных продуктов (рис. 2).
    • Рис. 2. Реакции получения пурпура Руэмана
    • Представлен этапами, включающими окислительное дезаминирование и декарбоксилирование исходной аминокислоты. Состав конечных продуктов и интенсивность окраски зависят от условий среды и структуры исследуемого вещества. Общий механизм полной схемы реакц...
    • Рис. 3. Образование натриевой соли хиноидной структуры динитротирозина желтого цвета (в центре) из тирозина (слева) и в натриевую соль динитротирозина оранжевого цвета (слева)
    • Появление желтого окрашивания при действии концентрированной азотной кислоты указывает на образование натриевой соли хиноидной структуры динитротирозина. При добавлении щелочи цвет смеси меняется на оранжевый. Образуется натриевая соль динитротирозина.
    • Эксперимент демонстрирует наличие в белке аминокислот с ароматическими кольцами, поскольку именно они обусловливают возникновение ярких окрасок при действии азотной кислоты и последующей обработкой щёлочью.
    • 1.1.4. Реакция на триптофан (реакция Шульце-Распайля)
    • Принцип метода: основана на конденсации триптофана с оксиметилфурфуролом, который образуется из углеводов (фруктозы, сахарозы) под действием концентрированной серной кислоты, с образованием окрашенных комплексов.
    • Преобразование углеводов при действии концентрированной серной кислоты молекула фруктозы теряет три молекулы воды и переходит в состояние оксиметилфурфурола (ОМФ):
    • C6H12O6+3H2O→HC(=O)−CH=O−(CH2)2−CHO
    • Оксиметилфурфурол вступает в реакцию конденсации с триптофаном с образованием окрашенных комплексов коричневого или красного цвета. Аналогичная реакция возможна и с сахарозой, которая предварительно подвергается гидролизу на глюкозу и фруктозу. Именно...
    • Таким образом, методика пригодна не только для выявления триптофана непосредственно в препаратах, но и на углеводные компоненты.
    • 1. К 1-2 мл раствора белка добавить 6 капель раствора сахарозы.
    • 2. Осторожно наслоить 1 мл H₂SO₄.
    • 3. Наблюдение: на границе раздела фаз появляется темно-красное кольцо.
    • 1.1.5. Реакция Адамкевича
    • Рис. 4. Образование продукта конденсации из триптофана и глиоксиловой кислоты
    • В качестве водоотнимающего средства используется концентрированная серная кислота (H2SO4).
    • Методика выполнения:
    • 1.1.6. Реакция Сакагучи
    • Принцип метода: Специфична для аргинина. Гуанидиновая группа аргинина окисляется гипобромитом, а продукт окисления конденсируется с α-нафтолом с образованием ярко-розового или красного соединения (см. рис. 5).
    • Рис. 5. Реакция образования продукта конденсации от взаимодействия аргинина с нафтолом
    • Реактивы: раствор белка (4 %), NaOH (10 %), α-нафтол (спиртовой р-р), гипобромит натрия (NaOBr, 2 %).
    • 1.1.7. Реакция Фоля
    • Принцип метода: Обнаруживает серосодержащие аминокислоты (цистеин, цистин). При щелочном гидролизе сера высвобождается в виде H₂S, который взаимодействуя с ацетатом свинца, образует черный или бурый осадок PbS (рис. 6).
    • Рис. 6. Реакция образования сульфида свинца
    • Реактивы: яичный белок, желатин (2 %), шерсть, NaOH (10 %), ацетат свинца (10 %).
    • Методика выполнения:
    • 1.1.8. Реакция Паули
    • Принцип метода: обнаруживает гистидин и тирозин (рис. 7).
    • Рис. 7. Комплексное соединение азокрасителя
    • Метод основан на диазотировании сульфаниловой кислоты и последующем образовании азосоединения вишнево-красного цвета с имидазольным кольцом гистидина или фенольной группой тирозина.
    • Реактивы: раствор белка (4 %), гистидин (0,01 %), сульфаниловая кислота (1 %), NaNO₂ (5 %), HCl (2%), Na₂CO₃ (10 %).
    • 1. В две пробирки добавить по 3 капли сульфаниловой кислоты и NaNO₂ (образуется диазореактив).
    • 2. В одну добавить 5 капель белка, в другую – 5 капель гистидина.
    • 3. Добавить по 3-5 капель Na₂CO₃.
    • 4. Наблюдение: Появление вишнево-красного окрашивания.
    • ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1.2.
    • ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ
    • 1.2.1. Высаливание белков
    • Высаливание белков ( это физико-химический метод выделения отдельных фракций белков из сложного раствора с помощью солей, например, сульфата аммония (NH4)2SO4.
    • Реактивы: яичный белок, (NH₄)₂SO₄ (насыщенный раствор и кристаллы), дистиллированная вода, HNO₃ (концентрированная), NaCl.
    • Методика выполнения:
    • Эксперимент № 1. Выделение глобулинов и альбуминов
    • Принцип метода: Растворение белка. В чистую пробирку вносят 0,5 мл неразбавленного яичного белка и добавляют 2,5 мл дистиллированной воды. Белок частично выпадает в осадок в виде белых хлопьевидных частиц глобулинов.
    • Эксперимент № 2. Обратимость процесса высаливания
    • Эксперимент № 3. Фракционирование белков солевыми смесями
    • 1.В две пробирки добавить по 3 мл белка и добавляют в одну пробирку насыщенный раствор хлористого натрия (NaCl), в другую ( раствор сернокислого магния (MgCl2). Спустя несколько минут появляется осадок глобулинов.
    • 2.Фильтруют жидкость от осадков глобулинов. Полученные прозрачные фильтраты содержат альбумины, которые остаются в растворе.
    • 3.К фильтратам добавляют уксусную кислоту.
    • 4.Наблюдерие: образование осадка альбуминов в слабокислой среде.
    • 5.Для проверки полного удаления белка из раствора используют биуретовую реакцию (отсутствие фиолетового окрашивания).
    • 1.2.2. Осаждение белков
    • Денатурация ( потеря нативной пространственной структуры белка (вторичной, третичной, четвертичной) с сохранением первичной. Приводит к потере биологической активности. Может быть обратимой и необратимой.
    • Факторы денатурации: температура, механическое воздействие, органические растворители, соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи. Органические растворители (этанол, фенолы и др.) способны взаимодействовать с боковыми группами аминокислот, меняя форму белка.
    • Основные виды денатурации. Первый вид (обратимая денатурация) после устранения фактора воздействия возможно восстановление нативной структуры белка. Второй вид (необратимая денатурация) утраченная структура не восстанавливается, белок теряет способнос...
    • Эти процессы имеют важное значение в биохимии и пищевой промышленности, влияя на функциональность белков и активность ферментов.
    • Эксперимент № 1. Осаждение белков с помощью спирта, ацетона
    • Принцип метода: Растворители, например этанол дегидратируют молекулы белка и снижают диэлектрическую проницаемость среды, что приводит к осаждению.
    • Механизм осаждения белков спиртом
    •  Спирт снижает доступность воды, необходимой для поддержания стабильности мицеллярной структуры белка.
    •  Дегидратация приводит к уменьшению устойчивости белковой частицы в растворе, вызывая её агрегацию и последующий выход из раствора.
    • Если осаждение белка проводится при низкой температуре и свежий осадок быстро отделён от спирта, белок сохраняет свою нативную структуру.
    • Длительное нахождение белка в спирте приводит к необратимой денатурации. Изменённая молекула белка утрачивает способность возвращаться в своё исходное состояние. Таким образом, правильное использование условий осаждения обеспечивает сохранение нативны...
    • Реактивы: раствор белка (4 %); порошок хлорида натрия (NaCl); спирт этиловый; ацетон.
    • Опыт № 1: Осаждение белка этиловым спиртом
    • 1. В пробирку добавьте 1-2 мл раствора белка. Положите небольшую щепотку твердого хлорида натрия (NaCl) и дождитесь полного растворения.
    • 2. Осторожно прилейте несколько миллилитров этилового спирта, тщательно перемешивая смесь.
    • 3. Наблюдение: примерно через несколько минут на дне пробирки появится тонкий слой мелкодисперсного осадка белка.
    • Опыт № 2: Осаждение белка ацетоном («кольцевой опыт»)
    • 1. Возьмите пробирку и добавьте в неё 1 мл раствора белка.По стенке пробирки осторожно добавьте 0,5 мл ацетона таким образом, чтобы жидкости не смешались сразу.
    • 2. На границе соприкосновения двух жидкостей вскоре проявится тонкое белое кольцо денатурированного белка.
    • 3. Наблюдение: эти опыты показывают различие механизмов осаждения белков в зависимости от выбранного растворителя и условий проведения эксперимента.
    • Эксперимент № 2. Осаждение белков солями тяжелых металлов
    • Белки активно реагируют с солями тяжёлых металлов (ртуть, свинец, серебро, медь и др.) с образованием стабильных комплексов. Для этих солей, достаточно минимальные концентрации тяжёлых металлов для эффективного осаждения.
    • Использование уксуснокислого свинца (Pb(CH3COO)2) или сульфата меди (CuSO4), избыточные концентрации солей могут привести к растворению первоначально образовавшегося осадка. Избыток катионов металла адсорбируется белковым комплексом, вызывая перезаряд...
    • Осажденные белки не возвращаются в раствор, даже после удаления солей путём диализа. Осадки нерастворимы ни в воде, ни в слабых солевых растворах. Осаждение солями тяжёлых металлов относится к категории необратимых процессов, сопровождающихся денатура...
    • Способность белков формировать хелаты с тяжелыми металлами используется в медицинской практике. Например, в медицине часто применяют молоко или яичные белки для экстренного обезвреживания отравлений солями ртути, свинца или меди, предотвращая всасыван...
    • Реактивы: 1) раствор белка (4 %); 2) раствор ацетата свинца (5 %); 3) раствор сульфата меди (1 %); 4) раствор нитрата серебра (5 %).
    • 2. Постоянно встряхивая, в первую пробирку добавьте раствор сульфата меди. Во вторую пробирку прилить раствор ацетата свинца.
    • 3. Наблюдение: в обеих пробирках наблюдаются характерные осадки белков. Если добавить избыток солей (ацетат свинца, сульфат меди). Отметить растворение первоначально образованных осадков.
    • Данный эксперимент показывает влияние солей тяжелых металлов на структуру белка и зависимость эффекта осаждения от концентрации реагентов.
    • Эксперимент № 3. Осаждение белков минеральными кислотами
    • Сильные кислоты (H₂SO₄, HNO₃, HCl) разрушают гидратную оболочку и изменяют заряд белковых молекул, вызывая денатурацию и осаждение.
    • Существуют особенности белков при действии различных кислот:
    •  При избыточном количестве серной кислоты образовавшиеся ранее хлопьевидные осадки вновь растворяются. Этот феномен объясняется возможностью переформирования зарядов на поверхности молекул белка и возможным частичным гидролизом пептидных связей, обле...
    •  Азотная кислота, напротив, сохраняет способность вызывать необратимое осаждение белка, не демонстрируя эффекта повторного растворения при увеличении концентрации.
    • Реактивы: концентрированная соляная кислота (HCl); 2) концентрированная серная кислота (H2SO4); 3) концентрированная азотная кислота (HNO3); 4) белок, раствор для осаждения.
    • Растворение осадка белка в соляной и серной кислотах обусловлено способностью этих кислот частично изменять зарядовую оболочку белка, что облегчает его дальнейшую диссоциацию и растворение. Напротив, азотная кислота образует прочные комплексы с белков...
    • Эксперимент № 4. Осаждение белков органическими кислотами
    • Трихлоруксусная кислота (ТХУ) – сильный денатурирующий агент, вызывающий необратимое осаждение белков.
    • Если нужно убрать следы ТХУ из фильтрата после осаждения белков, фильтрат кипятят, тогда ТХУ распадается на хлороформ и углекислый газ.
    • Реактивы: белок, раствор для осаждения; раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (10 %).
    • Эксперимент № 5. Осаждение белков при нагревании
    • Нагревание выше 50 C разрушает слабые связи, стабилизирующие структуру белка. Наибольшая коагуляция происходит в изоэлектрической точке.
    • Для свертывания белков при нагревании важно присутствие солей и концентрация водородных ионов (H+). Полная, быстрая коагуляция происходит в изоэлектрической точке, когда коллоидные частицы белка теряют электрический заряд и становятся наименее устойчи...
    • Реактивы: белок, раствор для осаждения; раствор СН3СООН (1 %); раствор СН3СООН (10 %); насыщенный раствор хлористого натрия; раствор NaOH.
    • Нагревать растворы белка в разных условиях по 0,5 мл реагентов (чистый; с 1 % CH₃COOH; с 10 % CH₃COOH; с CH₃COOH и NaCl; с NaOH) в пяти пробриках. Наблюдать образование или отсутствие осадка в зависимости от pH и ионной силы.
    • В третьей не образуется осадок из-за высокой концентрации ионов водорода, приближает среду к изоэлектрической точке.
    • В четвертой пробирке образуется осадок белка, соль усиливает коагуляционные процессы и нейтрализует поверхностные заряды молекул белка.
    • 1.2.3. Определение изоэлектрической точки
    • Суммарный заряд белковой молекулы ( соотношение анионных радикалов глутамина и аспарагина и катионных радикалов лизина, аргинина и гистидина (Биохимия, 2004).
    • Изоэлектрическая точка (pI) ( значение pH, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю. В этой точке белок наименее растворим. pl конкретного белка важна для оптимизации процессов экстракции, разделения и очистки белков, используемых в пи...
    • Белки клеток могут иметь больше анионогенных групп, то изоэлектрическая точка этих белков лежит в слабокислой среде. Изоэлектрическая точка белковс с катионогенными группами, находится в щелочной среде.
    • Эксперимент № 1: Определение изоэлектрической точки на примере желатина.
    • Реактивы: Na₂HPO₄ (0,2 М), лимонная кислота, (0,1 М), желатин (1 %), этанол (96 %).
    • Таблица 1
    • Варианты пробирок с разным соотношением фосфорнокислого натрия и лимонной кислоты
    • ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1.3
    • Приготовление стандартных растворов белка. Исходный раствор белка. Навеску: 0,1 г стандартизированного белка. Растворить в 100 мл дистиллированной воды.
    • Способ приготовления. Взвесьте необходимое количество белка на аналитических весах, перенесите в мерную колбу и доведите объем до отметки дистиллированной водой. При необходимости процедите раствор через фильтровальную бумагу.
    • Приготовление растворов с пониженной концентрацией белка
    • Используйте исходный раствор для серийного разведения, следуя указанным пропорциям (табл. № 2):
    • Таблица 2
    • Варианты растворов с фосфорнокислым натрием и лимонной кислотой
    • 1.3.2. Определение белка биуретовым методом
    • Таблица 3
    • Варианты пробирок с белком и водой
    • Таблица 4
    • Варианты пробирок с белком и водой
    • 1.3.5. Определение сорбционной способности по белку
    • Оценка способности сорбентов (например, активированного угля) связывать белки из раствора. Исходный и остаточный после сорбции раствор белка анализируют биуретовым методом. Степень сорбции рассчитывают по разнице концентраций. В 10 пробирок прилить ст...
    • ТЕМА 2. БИОХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ
    • ТЕМА 3. БИОХИМИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
    • Рис. 16. Гидролиз нуклеопротеинов
    • ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4.1. АЦИЛГЛИЦЕРИНЫ
      • Рис. 25. Реакция образование восстановленной формы витамина В2 (бесцветный)
      • Рис. 26. Структурная формула никотиновой кислоты и никотинамида (по: Principles of medical biochemistry, 2016)
      • Рис. 27. Структурные формулы форм витамина B6: пиридоксаль, пиридоксаль фосфат, пиридоксин, пиридоксамин (по: Principles of medical biochemistry, 2016)

Usage statistics

stat Access count: 0
Last 30 days: 0
Detailed usage statistics